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Etude de pathogénicité d’un nouveau gèn

Resumen

La fosforilación oxidativa mitocondrial (OxPhos) es un proceso metabólico esencial para la vida, que proporciona la mayor parte de la energía útil a las células del cuerpo. El mantenimiento de esta función es un caso particular en la célula, puesto que depende de contribuciones del genoma nuclear, que codifica la gran mayoría de las proteínas mitocondriales, y del genoma mitocondrial, que codifica un grupo limitado pero esencial de componentes del sistema OxPhos. Los defectos en su funcionamiento generan las enfermedades de la cadena respiratoria (RCD), que son muy difíciles de diagnosticar debido a la gran heterogeneidad clínica que presentan los pacientes. Sin embargo, una buena parte de lo que sabemos de la actividad y la regulación del sistema OxPhos viene del estudio de pacientes con defectos particulares.

La utilización de las técnicas modernas de secuenciación masiva han permitido identificar variaciones genéticas en el genoma de muchos pacientes. Esto no siempre lleva a un diagnóstico molecular porque la interpretación de las variaciones en el DNA puede resultar muy compleja. En algunos casos afectan a proteínas cuya función no se conoce, o no se relaciona con la ruta biológica afectada.

En este proyecto proponemos estudiar a nivel molecular la relación con el sistema Oxphos de una proteína defectuosa en un paciente con sospecha de enfermedad mmitocondrial. Se trata de una proteína de función hasta el momento desconocida. Desde mun punto de vista estructural, la actividad Oxphos tiene lugar en la membrana interna mmitocondrial, en la parece que se localiza esta proteína. La información obtenida de las mbases de datos biomédicas indica que la proteína tiene baja expresión y que se originó durante la evolución por duplicación génica de un gen que se ha encontrado alterado previamente en un paciente con enfermedad mitocondrial. En el paciente se ha encontrado una segunda mutación con menor probabilidad de ser el factor etiológico de la enfermedad, que también analizaremos dada la heterogeneidad de las patologías mitocondriales.

Objetivos que se pretenden alcanzar

El objetivo global de este proyecto es describir la función celular de la proteína ATAD3C y su relación con la función OxPhos. Esto permitirá un diagnostico molecular del paciente afectado, así como la posibilidad de desarrollar terapia personalizada.

Los objetivos concretos son:
1. Analizar los efectos de la proteína ATAD3C defectuosa en la función Oxphos y la dinámica mitocondrial utilizando fibroblastos derivados del paciente.
2. Estudiar el efecto de la eliminación de la proteína ATAD3C en la función Oxphos y la dinámica mitocondrial en líneas celulares modelo en las que se eliminará su expresión mediante ingeniería genética (RNAi y ó CRISPR/Cas9).
3. Clonar la proteína para estudiar el efecto de su sobreexpresión en la función Oxphos y la dinámica mitocondrial, tanto en fibroblastos de paciente como en líneas celulares modelo.
4. Comparar la expresión de la proteína ATAD3C y de las otras dos proteínas (ATAD3A y B) codificadas en el mismo locus génico. ATAD3B y C se generaron por duplicación génica de ATAD3A durante la evolución. Se estudiará tanto en fibroblastos del paciente como en modelos celulares con distintos estados de actividad OxPhos.
5. Estudiar mediante metabolómica el plasma y liquido cefalorraquídeo del paciente para obtener más información sobre los procesos metabólicos afectados.
6. Analizar la expresión del gen Magix y de la proteína correspondiente en fibroblastos del paciente y en fibroblastos control.

Gastos de ejecución

Para este trabajo, el grupo cuenta con personal con experiencia para llevar a cabo los experimentos. Se requiere financiación para material fungible y para costear gastos en servicios externos, como secuenciación, proteómica ó microscopía.
Por ello solicitamos 30.000 euros/año durante 3 años.
Los gastos por año se detallan a continuación:

Fungible:

Material de vidrio y plástico de un solo uso. 1500

Reactivos generales. 1500

Reactivos para el cultivo de células eucariotas, (Medio de cultivo, Suero Fetal Bovino; Antibióticos, reactivos de transfección, etc.) 4000

Kits para distintos usos (clonación de productos de PCR, extracción de plásmidos bacterianos, purificación de DNA; extracción de RNA; de síntesis cDNA, etc.) 9000

Reactivos de biología molecular (oligonucleótidos, Taq polimerasa, plásmidos, enzimas de restricción, enzima ligasa, anticuerpos, etc.) 10000

Gastos de servicios:

Gastos en contratación de servicios externos. Secuenciación de DNA, servicio de proteómica y servicio de microscopía. 4000

TOTAL POR AÑO 30000

TOTAL PARA 3 AÑOS 90000

Exécution: 100%