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Una aproximación multifactorial para avanzar en el estudio de las terapias para enfermedades mitocondriales neurodegenerativas, utilizando COXPD1 como modelo

La creciente incidencia de las enfermedades neurodegenerativas representa un enorme desafío, y su comprensión requiere enfoques multidisciplinarios.

La hepatoencefalopatía debida a la deficiencia combinada de la fosforilación oxidativa tipo 1 (COXPD1,OMMIN#609060) es una enfermedad mitocondrial debida a mutaciones en el gen nuclear GFM1 que codifica el factor de elongación mitocondrial G1 (EFG1). La COXPD1 se manifiesta desde edad muy temprana con hipo e hipertonia muscular, retraso del desarrollo, convulsiones, polineuropatía, microcefalia y rasgos dismórficos menores. Los rasgos neuroradiológicos más comunes incluyen estrechamiento del cuerpo calloso, leucodistrofia y afectación del ganglio basal. Es una enfermedad infantil ultrarara que cuenta con menos de
40 casos descritos en la literatura1-15, además de tres casos adicionales recientemente descritos en España y aun no publicados (comunicación personal).

La enfermedad progresa rápidamente y la mayoría de los pacientes mueren durante los primeros meses de vida, aunque existen algunos casos que presentan una mayor supervivencia1-10. Debido al escaso número de pacientes es difícil establecer una correlación entre las diferentes mutaciones en el gen GFM1 con la severidad del cuadro clínico y su pronóstico. Sin embargo, se ha observado que algunos de los pacientes con mayor esperanza de vida presentan la mutación c.2011C>T, que causa el cambio de aminoácido p.R671C2-4, 6.

Hasta hace poco el modelo de estudio de la enfermedad más utilizado eran los fibroblastos obtenidos de pacientes. El uso de este modelo ha resultado muy útil para el diagnóstico y caracterización fisiopatológica de la enfermedad COXPD1. Por otra parte, los fibroblastos de pacientes han permitido llevar a cabo rastreos farmacológicos para identificar pequeñas moléculas con potencial terapéutico16. No obstante, este tipo de aproximaciones, que son útiles para hacer screening de compuestos de alto rendimiento, deben ser complementadas con el testado en modelos animales de la enfermedad de las moléculas que demuestran resultados positivos en células cultivadas de pacientes, para identificar aquellas más prometedoras en base a su eficacia y farmacología.

Una de nuestras líneas prioritarias de investigación se ha centrado en los últimos años en el desarrollo de un modelo de ratón de COXPD1. Para ello, hemos generado un ratón knock-in (KI) Gfm1R671C portador de la mutación puntual en el gen Gfm1 que produce el cambio de aminoácidos en EFG1 que más frecuentemente se ha encontrado en pacientes de COXPD1 y asociado con mayor supervivencia. La caracterización del modelo ha mostrado que la mutación da lugar a una reducción drástica en la expresión de la proteína EFG1 (reducción del 85 % en hígado, 65 % en cerebro, 81 % en riñón y 88 % en corazón, en mitocondrias de ratones homozigotos para la mutación) sin que los niveles del ARN mensajero se vean alterados. Estos animales presentan además una reducción de la tasa de traducción mitocondrial en hígado y un descenso de la actividad del complejo CIV en el mismo tejido17.

Nuestros intentos por obtener ratones homocigotos knock-out (KO) en el gen Gfm1 revelaron que la ausencia del gen en homocigosis es letal en estado embrionario, de manera que sólo pudimos obtener ratones heterocigotos para el alelo KO. Todo ello demuestra la importancia de esta proteína para el desarrollo del ratón, y revela que pequeñas cantidades residuales de la proteína con esta mutación pueden evitar esta letalidad. Partiendo de estas observaciones, hemos generado un ratón heterocigoto compuesto Gfm1R671/KO (ratones KI/KO). Estos ratones son viables, pero presentan una mayor reducción de la cantidad de proteína EFG1 en mitocondrias de hígado que el modelo KI, lo que ocasiona una disminución de la tasa de traducción mitocondrial y un mayor déficit de la actividad de los complejos I y IV en hígado. Además, este modelo también
ha mostrado un déficit de la actividad de los complejos I y IV en cerebro, lo que demuestra que es un mejor modelo para el estudio de la enfermedad que el homocigoto KI17.

Este modelo animal único de COXPD1 nos va a permitir testar la eficacia de compuestos que muestren efectos positivos en screening sobre células derivadas de pacientes. La obtención de resultados positivos in vivo facilitaría la introducción de estos potenciales tratamientos farmacológicos a la fase clínica.

Por otra parte, la naturaleza monogénica de la COXPD1 hace que esta enfermedad sea una buena candidata para ser abordada mediante terapia génica. Durante las últimas décadas se ha desarrollado un número importante de terapias basadas en la trasferencia de genes o terapia génica para enfermedades de origen genético, en su mayoría enfermedades minoritarias18. Son numerosos los estudios preclínicos que demuestran un claro beneficio de la terapia génica para diversas enfermedades congénitas, además de otras enfermedades como algunos tipos de cáncer e infecciones virales crónicas. Más importante es el hecho de que algunos de estos estudios han sido transferidos a la práctica clínica demostrando la eficacia y seguridad de la terapia génica18.

En cuanto a las estrategias empleadas, los vectores lentivirales (LV) han sido utilizados de forma exitosa en terapias génicas ex vivo mediante la corrección de las células madre hematopoyéticas para algunas enfermedades como la adrenoleucodistrofia ligada al cromosoma X19, la leucodistrofia metacromática20, el síndrome de Wiskott-Aldrich21, la beta-talasemia22 y la anemia de Fanconi23, entre otras. Puesto que los LVs se integran en el genoma, facilitan una corrección genética permanente que permita la expansión de las células corregidas en cultivo para la posterior reinfusión. Sin embargo, la naturaleza integrativa de los LVs también puede ser un inconveniente debido a su potencial genotoxicidad, ya que la integración lentiviral se produce de forma aleatoria y pueden dar lugar a mutación insercional. Por este motivo, el uso de vectores no integrativos, como los vectores basados en los virus adenoasociados (AAVs) son actualmente la opción preferida para las estrategias de terapia génica in vivo. Los AAVs se han convertido en los vectores de transferencia líderes en el desarrollo clínico debido a su biología, estructura simple y ausencia de enfermedades asociadas conocidas. Además, un gran número de ensayos clínicos han demostrado que son
seguros y bien tolerados24. El uso de los AAVs puede ofrecer la corrección génica de un tejido específico tras su administración sistémica. Gracias a la combinación de diferentes cápsides víricas con un tropismo determinado, junto con la regulación de la expresión génica mediante promotores específicos, se puede dirigir la terapia a los órganos afectados25-27. Nuestra propuesta en este proyecto se basa en la introducción de la versión correcta del gen GFM1 en las células del cerebro y del hígado de los pacientes, utilizando un vector AAV. La disponibilidad del modelo murino17 nos ha resultado de suma utilidad para abordar este objetivo, ya que nuestros primeros resultados experimentales han demostrado que la introducción del gen humano GFM1 en el hígado del ratón mediante un vector AAV9 con promotor hepático restituye la expresión de la proteína EFG1 y su correcta traslocación mitocondrial. Pero lo más importante es que esta proteína restituida es funcional, ya que los ratones tratados recuperan la expresión de las subunidades de la cadena respiratoria codificadas por el mtDNA y la actividad de sus complejos I y IV (Molina-Berenguer, Martí et al, resultados preliminares no publicados). Todo ello ha sido observado en hígado, y uno de los objetivos de este proyecto es ampliarlo al cerebro, que es el otro órgano gravemente afectado en esta enfermedad.

Proponemos crear un Laboratorio de Clínicas del IRB orientado inicialmente a estudiar los mecanismos que controlan la síntesis de proteínas mitocondriales, y a buscar terapias en un trastorno neurodegenerativo, denominado COXPD1.

Ejecución: 25%